Главный герой - Дюк Нюкем — специальный агент правительства США, брутальный и насмешливый action hero, внешностью напоминающий Дольфа Лундгрена. В целом — один из самых колоритных героев компьютерных игр. По ходу действия может шутить и даже переругиваться с игроком. Реплики из игры быстро разошлись на цитаты.

Противники

На протяжении всей игры Дюк Нюкем встретит разнообразных противников, являющихся преимущественно инопланетными существами или мутировавшими людьми.

Пехотинец — рядовой пришелец, участник вторжения. Наиболее распространенный и наименее опасный противник. Имеет сходство с собакой. Один из двух представителей инопланетной рядовой пехоты.Вооружен бластером, может использовать реактивный ранец. Капитан (носит оранжевую броню) также имеет возможность становиться невидимым и телепортироваться с помощью специального устройства. После нескольких попаданий может свалиться на землю, прикинувшись мертвым, после чего встать и выстрелить в спину. Первый раз встречается на самом первом уровне, стоя на ящике.
Кабан-полицейский — антропоморфная свинья, мутировавший представитель полиции Лос-Анжелеса. Инопланетянином не является. Вооружен дробовиком, иногда стреляет из положения лёжа, становясь труднодоступным для попадания. Есть шанс, что из него выпадет бронежилет. Могут использовать патрульное воздушное транспортное средство. В Atomic Edition встречаются также кабаны на танках. Встречается первый раз в первом уровне. Отсутствуют на втором эпизоде .Однако у некоторых трупов есть дробовик!
Штурмовик — ящероподобный пришелец, вооружённый пулеметом. Последний представитель инопланетной пехоты. Старается появиться неожиданно, при визуальном контакте с целью ведёт сильный огонь на поражение, нанося серьёзный урон. При близком контакте может плюнуть кислотой в лицо. Может нагадить под ноги Дюка, и если тот вступит в дерьмо, то произносит фразу "Shit happens" . Первый раз можно встретить на первом уровне второго эпизода.
Командир — левитирующий на специальном устройстве пришелец. В устройство вмонтирована ракетная установка и лезвия, которыми пришелец атакует игрока в ближнем бою. Очень опасный противник, Игрок погибает при одном прямом попадании его ракеты. Единственный, кто показывает знание человеческого языка. Встречается первый раз на уровне Warp Factor
Слизняк — зелёное бесформенное существо, природа которого известна только создателю. С виду - обычный ком радиоактивной слизи. Выращивается и созревает в яйце, которое имеет прочную оболочку, которая правда, пробивается одним выстрелом из дробовика. Яйца иногда охраняются октабрейном. Когда яйцо почует потенциальную жертву или противника, оно раскрывается и выпускает слизняка наружу. Слизняки начинают неуклонно двигаться к противнику, избегая его возможного огня, прыгая и ползя по потолку. Как только слизняк окажется у жертвы, он запрыгивает на голову и пускает в ход резцы, чтобы разгрызть голову жертвы. В игре, при нападении слизняка, игрок видит его нижнюю поверхность, вместе с отверстием и резцами, и игроку даётся хороший шанс избавиться от слизняка, сделав выстрел из оружия или quick kick. Если этого не сделать, игрок погибает. Слизняки могут быть полезны тем, что атакуют и монстров (они попросту не обращают на слизняков внимания и становятся легкими жертвами). Встречаются очень часто с уровня Incubator.
Октабрейн — большой летающий мозг со щупальцами. Напоминает осьминога. На средних дистанциях атакует игрока энергетическими шарами, нанося серьёзный урон, вблизи — кусает. Прячется в тёмных местах или под водой, охраняет яйца слизняков. Первый раз встречается на Red Light District.
Турель — бластер, вмонтированный в потолок или пол. Является инопланетным устройством. Наносит несильный урон. Начиная с Death Row, встречается часто.Однако одну можно заметить в конце 1-го уровня,если использовать реактивный ранец.
Дроид смерти — летающий робот, при контакте с игроком взрывается. Эти роботы водятся в больших количествах во втором эпизоде, начиная с первого его уровня.
Патрульный гравилёт — пилотируемый PigCop'ом, летает по замкнутой траектории. Может зависнуть в воздухе, чтобы открыть огонь из бластеров по герою. При взрыве пилот катапультируется, то есть его приходится убивать отдельно.
Мини-предводитель — уменьшенная и ослабленная версия босса Предводителя (см. ниже).
Боссы — чрезвычайно сильные противники, встречаются в конце каждого эпизода. В ближнем бою просто давят игрока.
Предводитель — огромный, неповоротливый пришелец, вооруженный пулемётом и гранатомётом. Один из приближённых Императора, отвечает за захват земли. Также попадается во втором и третьем эпизодах в ослабленных формах.
Оверлорд — гигантский, похожий на жабу, пришелец. Имеет огромные зубы и клыки, а на его спине установлены ракетные установки. Командир флота захвата земли.
Император — одноглазый босс с вмонтированными в передние лапы ракетными установками. На небольших дистанциях может атаковать игрока энергетическими шарами, которые использует Октабрейн. Является самым главным среди всех монстров и боссов игры.

Кроме того, на протяжении всей игры могут встретиться нейтральные персонажи — это могут быть стриптизёрши, собаки, люди и даже механический Микки-Маус.

Оружие
Мощная правая и левая нога. Левой ногой можно «воспользоваться» и при применении другого оружия, до этого подобного в жанре не наблюдалось. По видимому добавлено для избавления от ползущих на игрока Слизней, не тратя патроны. Забавен тот факт, что в ранних версиях игры можно было атаковать противника обеими ногами одновременно. Если же при применении двух ног подойти к замороженному монстру, чтобы его разбить, на экране можно увидеть сразу три ноги (в ранних версиях).
Пистолет — автоматический, внешне напоминает «Glock 17».
Дробовик — мощное и красивое оружие. От расстояния мощность выстрела почти не зависит, разлёт картечи ближе к реальному (в других играх это всегда было главным ограничением на использование).
Пулемёт — скорострельное, но слабое оружие.
Ракетница — одно из самых мощных видов оружия, переносная ракетная установка.
Радиоуправляемая граната — после броска в руке Дюка появляется детонатор. Когда игрок держит в руках детонатор, можно снова нажать клавишу переключения на гранату и тогда можно будет бросить ещё одну. После активации детонатором все брошенные гранаты взрываются. Также, если во врага долго кидать гранаты, не взрывая их, то он умрёт.
Мины с лазерными сенсорами — устанавливаются на стены и другие вертикальные поверхности. Через несколько секунд после установки выпускают лазерный луч, пересечение которого приводит к взрыву мины. Стоит также отметить, что в настройках игры можно указать, видны ли лучи всегда, никогда или только в инфракрасном излучении.
Уменьшитель — на некоторое время уменьшает врага, после чего игрок может раздавить его. Сам игрок также подвержен действию уменьшителя — чаще всего это происходит вследствие отражения заряда уменьшителя от зеркала (это можно сделать как намеренно, так и случайно). После попадания заряда игрок на некоторое время становится очень маленьким и не может использовать своё оружие , но перемещается так же быстро, как и «большой» игрок. Как только время действия уменьшителя заканчивается, игрок снова увеличивается в размерах. Если при этом недостаточно места (например, если увеличение произойдёт в водостоке), то игрок погибает. Такой приём используется при переходе из помещения в помещение через очень маленькие проёмы. Уменьшенный враг не атакует игрока, поэтому используется в основном против особо опасных противников (Командир, Мини-предводитель). Не уменьшает туррели, дроидов, слизней (меньше некуда) трутней, танки и боссов.
Замораживатель — временно замораживает врага, после чего его можно разбить ногой или любым оружием. Если этого не сделать, через некоторое время монстр оттаивает и снова становится боеспособным, но всё равно умирает от первого же выстрела. Не замораживает турели и танки, но при длительном использовании замораживателя они взрываются. Если использовать его против уменьшенного противника, то при попадании (что проблематично) после оттаивания противник до конца минут своих останется маленьким и снова будет нападать на игрока, нанося при этом полный урон, как если бы он был большим, кроме того после такой процедуры его нельзя будет растоптать.
Разрушитель — двухствольная пушка,обладающая большой разрушительной силой. Секретная разработка Пентагона, что не мешает ей лежать практически на виду у игрока. Выстрел полного боезапаса (все 99 ракет) гарантированно убивает Императора.